高灵敏度太赫兹超材料对于生物组织切片的研究

摘要

太赫兹波在生物医学领域具有非电离、无标签、实时等优点，因此在该领域具有巨大的发展潜力。为了解决介电常数相近的生物组织之间的区分问题，设计并制造了一种具有Fano共振特性的超材料，并进行太赫兹反射成像实验。模拟和实验结果显示，在0.82 THz下，该超材料的反射灵敏度达到132 GHz/RIU。该超材料不仅可以提高标准成像分辨率板的对比度，还可以将肌肉组织和脂肪组织之间对比度提高约7.5%。这些结果表明，该超材料能够显著提高生物组织切片图像的对比度，为今后太赫兹应用于临床组织样本奠定了实验和理论基础。

关键词

太赫兹; 超表面; 灵敏度; 生物组织

太赫兹波是一种介于0.1~10 THz(波长为30~3 000 μm)频率范围内的电磁波，其位于微波和红外波之间^[1]。生物大分子(如蛋白质等)的旋转和振动能级大多处于太赫兹波段内，不同种类的细胞和生物分子也可以获得自己独特的指纹光谱^[2]。与此同时，太赫兹辐射的光子能量很低，仅为X射线的百万分之一，因此不会对生物组织和DNA的特性造成破坏。综上所述，太赫兹技术非常适用于生物组织切片的光谱和成像实验，尤其是区分癌症组织和正常组织。太赫兹医学成像依赖于组织中的含水量差异和结构变化进行成像。癌变或病变组织由于组织水肿和细胞增多，含水量较高，从而导致太赫兹吸收有所不同。同时，病变组织的微环境和细胞结构形态发生变化，进而导致最终成像结果的差异^[3-4]。太赫兹成像技术已广泛应用于乳腺、大脑、皮肤、肝脏、结肠癌、糖尿病足、骨组织、宫颈癌等方面^[5-12]。然而，由于太赫兹技术的灵敏度不够高，对于一些介电常数相似的生物组织，研究人员很难区分它们，从而无法实现根据太赫兹图像快速判别是否存在癌症组织，这是太赫兹技术无法真正应用于临床的原因之一。

为了增强太赫兹成像中介电常数相似生物组织的区别度，Quentin等采用了形态学扩展和折射率阈值的结合方法，分别实现了80%的乳腺癌组织分类敏感性和82%的特异性^[13]。但此方法并未从太赫兹技术方面解决问题。超材料作为一种人工合成的电磁材料，可以与太赫兹技术相结合，增强局部电场，从而增强太赫兹波与组织样本之间的相互作用，进而降低痕量物质的检测下限以及提高图像对比度^[14]。郑卓锐等人将太赫兹和超材料相结合构建了牛血清白蛋白传感器，其最低浓度检测限为0.3 mg/mL^[2]。徐文道利用单层石墨烯超材料实现了甲基毒死蜱检测下限达到0.2 ng^[15]。与此同时，研究人员将太赫兹成像技术与超材料相结合，提高了脑组织切片轮廓的清晰度，并改善了对海马体等不同区域的分类的准确度^[16-17]。因此，本研究设计并制作了一款新型双方形裂隙状超材料，旨在放大不同信号，提高太赫兹图像的对比度，并为解决介电常数相近的生物组织之间边缘性不准确的问题提供了理论基础。

本文提出了一种高灵敏度的太赫兹超表面，可用于生物组织切片的成像。该器件是由周期性排列的裂隙方形结构构成。模拟和实验结果显示，在反射模式下，该器件共有0.67 THz和0.82 THz两个共振频率，其中在0.82 THz下获得最高反射率灵敏度为132 GHz/RIU。对成像分辨率板和生物组织切片进行了太赫兹反射成像实验，实验结果表明，太赫兹超材料能够显著提高不同组织之间的对比度。本次研究结果为提高太赫兹成像技术在癌症组织切片等领域的图像对比度奠定了基础，同时也推动了太赫兹技术在临床样本检测方面的应用。

1 实验材料与方法

1.1 器件的设计、制造

为了实现对生物组织样本的快速高灵敏度检测，本文制作了如图1(a)所示的单元结构的超表面。图1(b)中结构单元中标注的优化后的结构参数如下：结构周期p=100 μm；裂隙宽g=6 μm；内环裂隙金属宽度6 μm；外环裂隙金属宽度5 μm。采用CST Microwave Studio软件的有限元法进行数值模拟和分析，太赫兹波垂直入射到超材料表面上，边界条件设置为：x、y方向上设置周期边界条件，z方向上设置开放边界条件，金的电导率σ=4.561×10⁷ S/m，衬底为厚度15 μm的硅(相对介电常数为11.9)。在制备工艺方面，首先在尺寸为4 in、厚度为300 μm的硅(相对介电常数11.2)上方磁控溅射镀膜Cr 50 nm/Au 200 nm，利用传统的光刻技术对金属层进行图案加工。为方便后续实验，将制作的超材料进行切割，每块超材料的尺寸为2 cm×2 cm，实物如图1(c)所示。

图1  超材料结构示意图

Fig.1  Schematic representation of the metamaterial structure

1.2 实验测试

本次实验所使用的为全光纤太赫兹时域光谱成像系统，其成像设备原理如图2所示。太赫兹实验频率范围为0.1~4 THz，光谱分辨率8 GHz，扫描精确度为2 μm，动态范围>70 dB，成像速度最大约为20 mm/s。根据样品所在样品台的位置，调节X、Y轴范围，步距设置为0.1 mm，对照实验采用裸硅进行。太赫兹光谱处理：获取光谱数据后利用Matlab软件将时域数据经过傅里叶变换获得频域数据，并且根据太赫兹图像处理方式：待扫描完成后储存实验数据，运行Matlab软件处理扫描数据并获得频谱动图，根据动图选取图像最清晰的共振频率，保存获取经过傅里叶变换的频谱图。

图2  全光纤太赫兹时域光谱成像系统原理图(PCA:光电导天线)

Fig.2  Schematic diagram of an all-fiber terahertz time-domain spectral imaging system(PCA:photoconductive antenna )

2 结果和讨论

2.1 超材料数值模拟实验

超材料的模拟(S₁₁(ω)为模拟的反射系数^[18])和实验反射率如图3所示，在0.2~1.0 THz范围内共有0.67 THz和0.82 THz两个反射共振频率。实验和模拟之间的差距主要源于以下几个因素：制造误差、实验过程中太赫兹波的损耗以及制作的衬底比模拟时的衬底厚导致内部折射。模拟的表面电流和电场、磁场结果分别如图4所示。如图4(a)所示，在0.67 THz频率下，内外裂隙环的表面电流方向相同，其共振频率为偶极共振。在0.82 THz频率下(图4(d))，发现内环的表面电流方向相反，此频率是通过打破结构对称性，获得了Fano共振，其共振可以等效为电容-电感共振。并且通过电场(如图4(b)、(e))和磁场(如图4(c)、(f))发现，在0.82 THz下，电场增强较为明显。为了评估超表面的传感性能，定义了传感器的光谱灵敏度(S)如下^[19]：

图3  超材料的反射率

Fig.3  Reflectance of metamaterial

$$S=∆f/∆n$$

(1)

图4  超材料的数值模拟图。(a)~(c) 是0.67 THz下的表面电流、电场、磁场示意图；(d)~(f) 是0.82 THz下的表面电流、电场、磁场示意图

Fig.4  The numerical simulation of the metamaterial. (a)~(c) are the schematics of the surface current, electric field, magnetic field at 0.67 THz; (d)~(f) are the schematics of the surface current, electric field, and magnetic field at 0.82 THz.

式中：$∆f$为反射率的共振频移；$∆n$是样品折射率的变化。在其他条件一定的情况下，传感器的灵敏度越大，对于一些微弱物质的检测能力越强，对物质的信号放大效果越好。

通过数据模拟可以获得超材料的谐振频率随被覆盖物的折射率变化而变化，如图5(a)所示。通过结果可以发现，当覆盖不同折射率的物质时，超材料的共振频移会出现不同程度的红移。绘制两个共振频率下的频移和折射率变化的曲线，如图5(b)所示。通过上述公式模拟计算可知，在0.1~1.0 THz 频率范围内，在0.82 THz频率下，反射率灵敏度为132 GHz/RIU。反射率定义为^[20]:

$$R\left(\omega \right)={\left|\frac{E(\omega )}{E_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{f}}(\omega )}\right|}^{\mathrm{2}}$$

(2)

式中$E(\omega )$和$E_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{f}}(\omega )$分别为样品信号和参考信号。

图5  超材料的灵敏度

Fig.5  Sensitivity of the metamaterial

2.2 生物组织切片实验

进行生物组织切片实验之前，首先对标准件——成像分辨率板进行了太赫兹成像实验。选择1.5 mm分辨率条，对其进行太赫兹成像对比实验，结果如图6(b)、6(c)所示，图6(b)是利用裸硅进行成像，图6(c)是利用超材料进行成像。通过对比可以发现，在设备、环境等条件相同的情况下实验，加上超材料进行成像的左侧两个分辨率条的中间部分的颜色偏蓝，即频域幅值更小。因此得出结论，超材料可以提高太赫兹成像的对比度，边界更加清晰。

图6  成像分辨率板实验

Fig.6  Experiment of imaging resolution plate

为了使生物组织切片与超材料充分接触，根据文献[21]制作了一款样本夹持装置。为了最大限度地减少夹板对于信号的影响，选择了聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯(GPPS)3种材料进行太赫兹反射光谱实验，最终获得反射率如图7(a)所示。介电常数GPPS>PP>PTFE，根据理论公式计算发现，反射率GPPS>PP>PTFE，根据实验的反射率计算(参考信号为透射空气)，可以发现在0.25 THz之前符合理论值，GPPS在1 THz之前均为最大值，符合理论情况，其他情况不符合可能是因为制作工艺或其中掺杂某些杂质造成的。最终选择GPPS作为样本夹板的材料。主要原因有以下2点：1) GPPS属于透明材料，可以在组织夹持过程中对样品进行观察，以防止压力过大导致的组织变形严重以及组织液渗出；2) 3种材料的反射率差值较小，研究学者们均采用GPPS作为样本夹^[22-23]。最终样本夹板如图7(b)所示。在实验过程中，将超材料放置在下方的GPPS上，并将组织样品平铺在超材料表面上。使用4个螺栓连接，以确保样本与GPPS均匀贴合。在连接过程中，要注意观察组织是否被挤压过度。在实验过程中，只需确保样品底部与GPPS轻轻贴合即可，不需过度挤压。本次实验中样品尺寸较小，水分含量对最终脂肪-肌肉组织的分界线影响不大，并且太赫兹设备成像速度较快，因此本次实验并未考虑样品失水问题。

图7  样品夹持装置

Fig.7  Splint device for sample

首先获取了新鲜猪肉组织样品切片(含脂肪和肌肉组织)，未使用夹持装置进行了太赫兹成像实验。其脂肪-肌肉组织的实验结果如图8所示。肌肉的介电常数、含水量均大于脂肪，理论上肌肉的反射率大于脂肪，从图8(b)、8(d)所示的实验结果发现，0.59 THz和0.68 THz频率下，肌肉组织的频谱平均数值均大于脂肪组织，在参考信号相同的情况下，可以计算获得肌肉组织的反射率大于脂肪组织，其结果与理论相符合。然而通过结果发现，两种组织之间的分界线非常明显，但外轮廓结果不明显。造成这种现象的主要原因是样品在外暴露太久导致水分流失，肌肉部分已经出现干瘪情况，肌肉外轮廓翘起，无法与材料相贴合，从而导致了上半部分外轮廓的缺失。

图8  (a)和(c)分别是相同组织在裸硅和超材料上的可见光图像；(b)和(d)分别是组织在裸硅和超材料上的太赫兹图像。红线表示肌肉组织和脂肪组织的分界线。

Fig.8  (a) and (c) are visible light images of the same pork tissue on bare-silicon and metamaterial, respectively; (b) and (d) are THz images on bare-silicon and metamaterial, respectively. The red lines show the dividing between muscle tissue and fat tissue

随后重新获取一块新鲜猪肉组织样品切片(含脂肪和肌肉组织)，使用夹持装置进行了太赫兹成像实验。实验结果(0.377 THz频率)如图9所示，无论在裸硅还是超材料上进行成像，肌肉组织的频谱平均数值均大于脂肪组织，与理论相符合，并且使用夹持装置后，其组织变得更加清晰，减少了组织翘边现象。如图9(b)所示，生物组织在裸硅表面上进行太赫兹成像时，肌肉组织的平均值约为0.482 8，脂肪组织之间的平均值约为0.141，两者相差0.341。当采用超材料作为组织成像时(如图9(c)所示)，肌肉组织的平均值(0.769)与脂肪组织的平均值(0.353)之间的差值约为0.416，根据两组数据对比，利用超材料进行太赫兹成像时，肌肉-脂肪组织之间的对比度有所提高。实验结果验证了超材料对于提高不同组织之间对比度的性能，为今后鉴别相同介电常数的组织打下了基础。

图9  太赫兹成像实验

Fig.9  THz imaging experiment

3 结论

本文设计并制作了一款具有高灵敏度的太赫兹超材料，并将其应用于生物组织样本。实验结果表明，通过使用超材料可以提高标准成像分辨率板的对比。脂肪-肌肉组织之间的图像对比度明显提高，验证了本文所设计制作的超材料具有灵敏度高、操作简单等优点。后续通过进一步优化超材料生物材料和结构，获得具有更高灵敏度的超材料，进而可以对介电常数相近的组织切片进行区分。本次研究的结果推动了今后太赫兹技术应用于临床医学，为医生提供一种快速有效的诊断方法。