太赫兹辐射对小鼠脑神经发生及认知能力的影响

摘要

为探究太赫兹(THz)辐射对成年小鼠海马齿状回亚颗粒区(SGZ)神经发生及对老年小鼠认知能力的影响，用0.14 THz波照射实验小鼠头部，10 min/次，2次/d，连续21 d，对照组小鼠进行相同时间的麻醉。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色评价新生细胞存活、BrdU/神经元细胞核(NeuN)染色评价细胞分化、Morris水迷宫(MWM)实验分析认知能力变化。实验结果表明：与对照组相比，0.14 THz 10 min/次，2次/d，连续照射21 d后，可有效促进成年小鼠SGZ神经发生，成年小鼠SGZ新生细胞存活明显改善(P<0.05)，新生细胞向神经元的分化无明显改变。老年小鼠逃避潜伏期，运动寻找轨迹无显著变化，THz辐射没有影响老年小鼠的空间认知能力。

关键词

太赫兹; 亚颗粒区; 神经发生; 认知能力

成体脑内有持续的神经元发生现象，海马齿状回亚颗粒区(SGZ)是脑内神经发生的重要区域，位于海马齿状回SGZ的祖细胞产生颗粒细胞，这些颗粒细胞添加到齿状回导致成年海马的神经发生^[1-2]。海马神经发生活动是维持海马功能的重要过程，在海马依赖性任务和压力诱导行为等相关研究中，海马齿状回SGZ神经发生被证实与学习和记忆相关^[3-4]。太赫兹(THz)波是指频率在0.1~10 THz内的电磁波，THz波光子能量较低，且THz频段覆盖了生物大分子的振动和旋转频率，因此THz辐射对生物具有良好的安全性，同时THz辐射可有效调控生物功能^[5]。研究表明，神经系统对THz辐射较为敏感。THz辐射对神经元的作用，与THz波的参数，如功率、频率、暴露时间等密切相关。THz辐射对神经细胞的神经递质和突触生长具有明显效应^[6-7]，且神经冲动以THz波沿神经系统传输^[8]。THz辐照对小鼠脑神经发生及学习记忆能力的影响尚未见报道，本文研究了THz局部照射对C57小鼠海马齿状回SGZ神经发生的影响，包括细胞增殖、分化和存活。同时也研究了THz辐射是否可以改善C57老龄鼠的认知功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

C57雄性小鼠购买并饲养于西安交通大学动物实验中心，18月龄成年鼠10只，24月龄老年鼠20只(随机分为两组，每组10只)。3组小鼠随机分为太赫兹照射组(THz组)和对照组(Con组)(n=5)。本研究中的实验均根据动物福利指南进行并经伦理委员会批准。

1.2 太赫兹源

使用俄罗斯生产的IMPATT diode 140 GHz太赫兹发生器(Tera，200385)，太赫兹源的工作参数为：电压24 V；电流0.3 A；整体功率90 mW；发射太赫兹频率0.14 THz。

1.3 其他主要试剂与仪器

冰冻切片机(Slee Technik,Mainz,Germany)；Rabbit anti-NeuN(Millipore,USA)；Biotinylated anti-rabbit IgG (Vector,USA)；DAB(Boster,China)；Mouse anti-BrdU(Vector,USA)；Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG(ZSGB-Bio,China)；FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG(ZSGB-Bio,China)；荧光显微镜(TCS,Sp2,Leica,Germany)；Rabbit anti-Ki-67(Abcam,UK)；FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG(ZSGB-Bio,China)；MWM视频分析系统(成都泰盟)。

1.4 实验方法

使用发射频率为0.14 THz的太赫兹源照射成年小鼠和老年小鼠，使用各种染色方法评估小鼠的神经发生情况，对老年小鼠使用水迷宫测验评估其认知功能的改善情况。本研究的实验方法如图1所示。

图1  研究技术路线图

Fig.1  Technology roadmap for research

1.4.1 太赫兹照射小鼠

小鼠吸入麻醉剂异氟醚麻醉，维持麻醉剂流量。小鼠头部备皮，将THz发射器紧贴顶骨，中心点与两外眦成等边三角形。THz组小鼠每次照射10 min，2次/d，连续21 d。Con组小鼠只进行相同时间的麻醉。

1.4.2 制备小鼠海马冰冻切片

18月龄小鼠，THz组在末次照射后，深度麻醉所有小鼠，依次用20 ml生理盐水和100 ml 4%多聚甲醛灌注，取脑，30% sucrose过夜。冰冻切片机切取40 μm厚冠状位切片，取材范围为前囟后1.22~3.40 mm。连续切片，每6张为1组，分别放置于6个染色盘中，每个染色盘中包含有间隔为200 μm的全部海马脑片。

1.4.3 Nissl染色

M TBS-TX清洗脑片；0.5% toluidine blue solution染色10 min。切片依次置于二甲苯I、二甲苯II各15 min，然后梯度酒精脱水：100%I,100%II,95%,90%,80%,70%,50%各5 min；蒸馏水冲洗3次，每次5 min；置于60 ℃温箱用0.5% toluidine blue solution染色10 min；蒸馏水洗净染料后，分别置于70%，80%和95%以及100%乙醇中脱水，最后置于二甲苯中，中性树胶封片。

1.4.4 神经元细胞核(NeuN)染色

M TBS-TX清洗脑片；用TBS-TX稀释一抗Rabbit anti-NeuN(1:1 000,Catalog No. MABN140)至工作浓度，孵育过夜；TBS-TX清洗，用Biotinylated anti-rabbit IgG(1:200 for Ki-67, Catalog No. PK-4001)孵育2~4 h；Avidin-biotin complex ABC复合物孵育2 h；TB清洗，0.05% DAB(Catalog No. AR1022)显色3 min。

1.4.5 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记及染色

实验开始之前，小鼠均腹腔注射BrdU(50 mg/kg)。M TBS-TX清洗脑片；2N HCL 孵育30 min；用TBS-TX稀释一抗Mouse anti-BrdU(1:300,Catalog No. VP-B209)至工作浓度，孵育过夜；TBS-TX清洗，用Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG(1:200,Catalog No. 0311)孵育2 min；用FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG(1:200,Catalog No. 0313) 孵育2~4 h。

1.4.6 细胞计数

细胞计数在荧光显微镜下进行。每只动物计数一个染色盘中的全部脑片，每张脑片计数双侧SGZ-颗粒细胞层(Granule Cell Layer，GCL)全部BrdU和NeuN阳性细胞。Ki-67染色计数SGZ阳性细胞。

1.4.7 胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)染色

GFAP染色步骤包括：M TBS-TX清洗脑片；用TBS-TX稀释一抗Rabbit anti-Ki-67(1:500,Catalog No. ab15580)至工作浓度，孵育过夜；用FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG(1:200,Catalog No. 0313)孵育2~4 h。

1.4.8 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)染色

24月龄小鼠，THz组末次太赫兹照射后用RV-GFP标记SGZ神经干细胞。实验步骤包括：小鼠吸入1%异氟醚麻醉，用耳架将动物固定于立体定位仪，定位并颅骨钻孔。RV-GFP注射坐标(每侧齿状回注射两个位点)：前囟后2.1 mm，中线旁1.3 mm，距离脑表面深度2.3 mm；前囟后2.1 mm，中线旁2.5 mm，距离脑表面深度3.0 mm。病毒滴度和注射量：每个点注射1.5 μl(3×10⁹ CFU/ml)；注射方法：微量注射器，0.3 μl/min，注射后将针头滞留1 min。GFP荧光显微镜观察，计数SGZ的GFP阳性细胞数量。

1.4.9 Morris水迷宫(MWM)实验

24月龄小鼠，THz组末次太赫兹照射后进行MWM实验。采用WMT-100型MWM视频分析系统。设备包括一个直径120 cm、高60 cm的表面涂黑色无毒漆料的圆形水槽。水槽内注水高度40 cm。水槽以中心点平均分为4个象限。直径10 cm、高35 cm的无色透明逃避台置于第四象限水面下。系统采用彩色图像处理算法，实时跟踪小鼠运动轨迹，可以统计分析实验动物在4个象限滞留时间、4个象限运动距离、4个象限进入次数、外/中/内环滞留时间、外/中/内环运动距离、外/中/内环进入次数、朝向角、逃避潜伏期、平台区/有效区穿越次数和停留时间、运动轨迹等参数。水槽上方的摄像装备与分析系统连接。检测时只允许操作人员入内，操作人员按规定路线操作和站立。实验期间房间内物品不可随意改变位置，实验室保持80%湿度，水槽内部加热器维持水温25 ℃。

MWM实验共6天，第1~5天为定向巡航实验，2次/d，间隔30 min。每次训练，小鼠分别从4个不同象限的标定位置面向池壁入水，发现逃避平台时间计为潜伏期；如动物在60 s内未能发现逃避平台，将动物牵引到逃避平台并允许其滞留10 s，潜伏期计为60 s。每次游泳后动物用干毛巾擦干，在干燥鼠笼中休息30 min。定向巡航实验后3天的潜伏期采用重复测量的方差分析。第6天为空间探索实验：撤掉逃避平台，动物仍分别从4个不同象限的标定位置入水，观察记录动物在60 s内的运动寻找轨迹。

1.5 统计学方法

采用SPSS 9.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以平均值±标准差(Mean±SD)表示，t检验用于比较两组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新皮质细胞构筑变化

NeuN(a,b)/Nissl(c,d)染色(图2)发现，THz组动物新皮质各层(I-Ⅵ层)构筑清晰，与Con组无明显差异，各层无明显细胞或神经元丢失。THz照射没有明显影响新皮质细胞构筑。图(a)~(d)的比例尺为100 μm。

图2  新皮质细胞NeuN/Nissl染色图

Fig.2  NeuN/Nissl staining images of neocortical cells

2.2 海马细胞构筑变化

NeuN(a,b)/Nissl(c~j)染色(图3)发现，THz组动物海马CA区起始层(Stratum Oriens，SO)、椎体层(Stratum Pyramidale，SP)、辐射层(Stratum Radiatum，SR)、腔隙分子层(Stratum Lacunosum-Moleculare，SLM)和齿状回区分子层(Stratum Dentate gyrus-Molecular，SM)、颗粒层(Stratum Granulosum，GC)以及门区(Hilus，Hi)构筑清晰，与Con组无明显差异，各层无明显细胞或神经元丢失。THz照射没有明显影响海马细胞构筑。图(a)~(j)的比例尺为100 μm。

图3  海马细胞NeuN/Nissl染色图

Fig.3  NeuN/Nissl staining images of hippocampal cells

2.3 SGZ新生细胞存活

BrdU染色(图4)发现，THz组(图(b))SGZ-GCL的BrdU阳性细胞数量较Con组(图(a))明显增多(图(c))，THz照射明显改善了小鼠SGZ新生细胞的存活。图(a)~(b)比例尺为100 μm。

图4  SGZ新生细胞BrdU染色图(*:P<0.05)

Fig.4  BrdU staining images of SGZ newborn cells(*: P<0.05)

2.4 SGZ新生细胞向神经元的分化

BrdU/NeuN染色(图5)发现，THz组(图(b),B1~B3)SGZ-GCL的BrdU/NeuN阳性细胞数量占BrdU阳性细胞总量的比例，与Con组(图(a),A1~A3)无明显差异(图(c))。THz照射没有明显改变小鼠SGZ新生细胞向神经元的分化。图(a)~(b)比例尺为100 μm；A1~A3和B1~B3比例尺为50 μm。

图5  SGZ新生细胞向神经元分化BrdU/NeuN染色图

Fig.5  BrdU/NeuN staining images of SGZ newborn cells differentiating into neurons

2.5 海马胶质细胞增殖

GFAP染色(图6)发现，THz组(图(b))海马GFAP阳性细胞数量和形态与Con组无明显差异。THz照射没有明显改变小鼠海马胶质细胞的增殖。图(a)~(b)比例尺为100 μm。

图6  海马胶质细胞GFAP染色图

Fig.6  GFAP staining images of hippocampal glial cells

2.6 老年小鼠SGZ细胞存活

GFP染色(图7)发现，THz组(图(a))老年小鼠RV-GFP标记的GFP阳性细胞数量与Con组(图(b))相比没有显著变化(图(c))，THz照射没有明显改变SGZ新生细胞的存活。

图7  SGZ新生细胞GFP染色图

Fig.7  GFP staining images of SGZ newborn cells

2.7 老年小鼠空间认知能力变化

THz照射没有显著改变动物定向巡航实验的逃避潜伏期(图8)，THz照射没有改善或影响老年小鼠海马依赖的空间认知功能。

图8  Con组和THz组小鼠在定向巡航实验的逃避潜伏期

Fig.8  Escape latency of Con group and THz group mice in the oriented cruise experiment

THz照射没有明显改变动物空间探索实验的游泳轨迹(图9)。

图9  Con组(a)和THz组小鼠(b)在空间探索实验中的游泳轨迹

Fig.9  Swimming trajectories of mice in the Con group (a) and THz group (b) in the space exploration experiment

在空间探索实验中，THz组和Con组动物在目标象限的滞留时间无明显差异(图10(a))，THz照射没有影响小鼠在目标象限的滞留时间；THz组和Con组动物在目标区域的滞留时间无明显差异(图10(b))，THz照射没有影响小鼠在目标区域的滞留时间；THz组和Con组动物穿越目标象限的次数无明显差异(图10(c))，THz照射没有影响小鼠穿越目标象限的次数；THz组和对照组动物穿越目标区域的次数无明显差异(图10(d))，THz照射没有影响小鼠穿越目标区域的次数。THz组和Con组小鼠在实验中的游泳速度无明显差异(图10(e))。

图10  空间探索实验中，Con组和THz组小鼠在目标象限（a）和目标区域（b）的滞留时间，小鼠穿越目标象限（c）和目标区域（d）的次数，以及实验中两组小鼠的游泳速度（e）

Fig.10  In the space exploration experiment, the retention time of the mice in the target quadrant (a) and the target area (b) in the Con group and the THz group，the number of times the mice crossed the target quadrant (c) and the target area (d)，and swimming speeds of mice in the experiment of two groups (e)

3 讨论

海马齿状回SGZ的神经干细胞可产生谷氨酸能神经元并整合到海马神经回路中^[9]，海马神经发生活动与学习、记忆能力相关。基于目前THz辐射在神经系统的研究，THz辐射被认为对神经细胞的关键功能具有调控作用，因此本实验探究了THz对小鼠海马齿状回SGZ神经发生的影响。各研究指标及THz辐射对其影响如表1所示。

表1  各研究指标及结果

Table1  Research indicators and results

mouse classification	indicator	influence
the adult mouse	cellular architecture of neocortex and hippocampus	no change
	survival of SGZ newborn cells	improved significantly
	differentiation of newborn cells into neurons	no change
	proliferation of hippocampal glial cells	no change
the elderly mouse	survival of SGZ newborn cells	no change
	spatial cognition	no change

Nissl分布于神经元胞体或树突内，在光镜下为颗粒状(小神经元)或斑块状(脊髓运动神经元)。当神经元受到损伤时，Nissl出现解体，因此Nissl可作为神经元功能状态的标志^[10]。NeuN在正常脑组织的椎体神经元和颗粒性神经元中表达，能够在成年小鼠中枢和外周神经系统的多数神经细胞类型中检测到^[11]。Nissl/NeuN染色可观察THz照射对新皮质细胞构筑和海马细胞构筑的影响。本研究中THz组Nissl/NeuN结果与对照组无显著差异，THz照射不改变小鼠新皮质和海马细胞构筑。BrdU是一种胸苷类似物，在DNA合成期可替代胸腺嘧啶核苷选择性与DNA结合，从而检测DNA合成和标记细胞分裂、凋亡等行为，是常用的细胞增殖标记物^[12]。本研究中BrdU免疫荧光染色用于观察和分析新生细胞存活，BrdU/NeuN免疫荧光染色用于观察和分析新生细胞分化。THz组小鼠BrdU阳性细胞数量增加，BrdU/NeuN阳性细胞数量没有发生显著变化。表明THz辐射明显改善了SGZ新生细胞的存活，同时不改变SGZ新生细胞向神经元的分化。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，星形胶质细胞占据了大多数哺乳动物的大脑细胞。星形胶质细胞具有对神经活动的调制作用，星形胶质细胞功能障碍严重影响神经元生存^[13]。GFAP免疫荧光染色可用于观察海马胶质细胞增殖。THz组GFAP结果与对照组无显著差异，表明THz没有改变海马胶质细胞的增殖。

前部分研究表明，小鼠头部THz照射3周可以改善海马SGZ新生细胞存活。老龄啮齿类动物和人类海马SGZ神经发生活动明显减弱，被认为是与年龄相关认知能力下降的关键因素^[14]。因此，接下来研究THz照射是否可以改善老年小鼠的认知功能。24月龄C57小鼠可作为老年鼠模型^[15]。

GFP作为一种分子探针，在基因标记、转基因动植物研究、蛋白功能定位及蛋白互作用等方面有广泛用途^[16]。本研究中RV-GFP染色用于观察新生细胞存活。本研究结果表明，THz组GFP结果与对照组无显著差异，THz照射没有改变老年小鼠海马齿状回SGZ新生细胞的存活。MWM实验主要用于测试实验动物对空间位置和空间定位的学习与记忆能力，广泛用于海马研究，是学习与记忆研究的首选经典方法^[17]。本研究结果显示，THz组各项指标与对照组无显著差异，说明THz照射没有影响或改善老年小鼠海马依赖的空间认知功能。

4 结论

综上所述，THz辐射可促进成年小鼠海马齿状回SGZ神经发生，同时不影响海马齿状回SGZ新生细胞向神经元的分化，并且具有良好的生物安全性。但THz辐射没有影响或改善老年小鼠海马依赖的空间认知功能。研究首次探索了THz辐射对小鼠海马齿状回SGZ神经发生的作用，以及对老年小鼠认知能力的影响。